QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ – Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Cao Bằng

Chủ nhật – 29/11/2020 16:21

1. Xuất xứ quy trình
Cây Lan Kim tuyến hay còn gọi là Lan gấm, cây Kim cương.
Tên khoa học là: Anoectochilus setaseus. Blume
Cao  Bằng là tỉnh có nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú, đa dạng, có nhiều loài thực vật quý hiếm, trong đó cây Kim tuyến là cây rất quý nằm trong sách đỏ Việt nam.
Để bảo tồn cây Lan Kim Tuyến, ngoài các giải pháp như bảo vệ cây mọc ở rừng tự nhiên, đem cây về trồng chăm sóc tại vườn thì giải pháp áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô là biện pháp tối ưu nhất với nhiều đặc điểm ưu việt như : Cho hệ số nhân cao, chủ động được thời gian ra cây giống, bảo vệ tốt nguồn Gen quý hiếm.
      Hóa chất sử dụng cho môi trường nuôi cấy cần được chuẩn bị trước  ở dạng đậm đặc và bảo quản trong tủ lạnh, khi sử dụng pha loãng ra. Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy mô Lan Kim tuyến là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có các thành phần trong bảng sau:
 

STT Tên hóa chất Trọng lượng hóa chất (g) Số ml cho 1 lit dung dịch mẹ
1 KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
KH2PO4
95,000
87,500
18,500
8,500
20
2 CaCl2.H2O
Hoặc CaCl2
44,000
33,225
10
3 H3BO3
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
KI
0,62
2,23
0,86
0,083
10
4 Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
3,73
1,76
10
5 Glycine
Myoinositol
Thyamin HCl (B1)
Pyridoxine HCl (B6)
Nicotinic acid (B5)
0,2
10
0,051
0,05
0,05
10
6 Na2MoO4.2 H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
0,025
0,0025
0,0025
2

 
Chuẩn bị các chất điều hòa sinh trưởng: các chất điều hòa sinh trưởng cũng được pha đặc ở dạng dung dịch gốc gồm các chất trong bảng sau:

Stt Tên hóa chất Dung môi hòa tan Nhiệt độ bảo quản
1 BAP NaOH 4oC
2 Kinetin NaOH 0oC
3 NAA NaOH 4oC

 
2. Quy trình thực hiện
Quy trình nuôi cấy mô cây lan Kim Tuyến invitro trong phòng thí nghiệm bao gồm 4 giai đoạn chính từ giai đoạn chọn vật liệu khởi đầu đến giai đoạn ra rễ tạo được cây hoàn chỉnh.
2.a. Chọn vật liệu khởi đầu:
 Vật liệu được sử dụng để cấy mô in vitro cây Lan Kim tuyến trong phòng thí nghiệm là các lóng giữa và chồi đỉnh của cây Kim tuyến khỏe mạnh, có chiều cao khoảng 15 – 20 cm, được thu hái từ rừng tự nhiên.
Cây Kim Tuyến là loài thực vật dạng thân bò, chia đốt. Trên mỗi đốt hình thành 1 rễ và 1 chồi đối xứng nhau. Chồi ngủ của cây trên mỗi đốt được bao bọc bởi các bẹ lá. Chính vì vậy, vật liệu khởi đầu để tiến hành vi nhân giống cây lan Kim Tuyến là phần thân chồi, đặc biệt là những chồi mập, khỏe và vươn cao khỏi mặt đất.
Ở giai đoạn này mục đích là tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu vô trùng đưa vào nuôi cấy.
Cây Lan Kim tuyến sau khi thu hái ở rừng được bảo quản cẩn thận cây còn nguyên, không được dập nát khô héo. Sau đó, chọn những cây mập có đường kính từ 3-5mm trở lên (cây mập sẽ cho chồi khỏe và có khả năng tái sinh cao); cắt bỏ phần rễ, phiến lá (giữ lại phần bẹ lá có tác dụng bảo vệ chồi ngủ). Rửa mẫu cấy bằng nước sạch sau đó đưa mẫu vào bình thủy tinh lắc đều với dung dịch xà phòng trong 10 phút. Tráng sạch xà phòng 7 lần bằng nước cất.
2.b. Tái sinh mẫu nuôi cấy (6 – 7 tuần).
Tiến hành trong box cấy vô trùng với 2 bước.
– Bước 1: Khử trùng mẫu.
Mẫu sau khi đưa vào box cấy vô trùng sẽ được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70o, sau đó đưa mẫu vào bình thủy tinh vô trùng lắc đều với dung dịch HgCl2 0,1%. Với thời gian là 10 phút. Tráng lại mẫu nhiều lần bằng nước cất vô trùng 2 lần( khoảng 6 -7 lần sẽ rửa sạch được dung dịch HgCl2­  còn dư trong mẫu)  mẫu nuôi cấy sẽ có tỉ lệ vô trùng cao. Sau đó cắt thành từng đốt dài từ 2-3 cm  rồi cắm mẫu cấy vào môi trường MS đã chuẩn bị trước 1 tuần ( môi trường chuẩn bị trước 1 tuần mục đích nhằm hạn chế phát hiện môi trường nhiễm khuẩn, nấm).
Bước 2: Chuyển mẫu sang môi trường tái sinh.
Sau khi mẫu được cấy khoảng 3 tuần từ lúc khử trùng, quan sát các mẫu, mẫu nào xanh, không bị chết và nhiễm khuẩn sẽ tiến hành tách bỏ những đoạn đã bị dập  (chú ý không gây tổn thương các chồi ngủ). Sau đó dùng panh dài gắp và cắm mẫu nuôi cấy lên môi trường tái sinh vô trùng được chuẩn bị trước 1 tuần.
Môi trường cấy tái sinh:
½ MS + 1 mg/l KI + 1mg/l BAP + 10% Nước dừa+ 50g/l chuối+ 6,5g/l agar + 20g/l đường
2. c.  Nhân nhanh chồi ( 7 tuần).
Được tiến hành trong box cấy vô trùng.
Sau khi đưa mẫu, chồi được tái sinh, tiến hành nhân nhanh chồi. Đưa mẫu ra khỏi bình môi trường cũ, tiến hành tách chồi mới tái sinh khỏi phần thân cũ. Lưu ý không làm tổn thương chồi cây, không nên cắt quá sát phần gốc chồi. Sau đó tiến hành cấy chồi vào môi trường nhân nhanh đã được chuẩn bị trước 1 tuần.
Môi trường nhân: MS + 3,0mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 6,5g/l agar + 50g/l khoai tây + 10% Nước dừa+ 20g/l đường + 50g/l chuối.
2.d. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (7 – 8 tuần).
Tiến hành trong box cấy vô trùng.
Sau quá trình nhân nhanh chồi sẽ được nuôi lớn ( cây khỏe mạnh, nhanh thích nghi với môi trường bên ngoài. Sau đó tiến hành cấy chuyển sang môi trường tạo rễ đã được chuẩn bị trước 1 tuần. Ở giai đoạn này, chỉ tiến hành tách chồi chứ không chia nhỏ, cắt bỏ rễ như giai đoạn nhân nhanh.
Môi trường ra rễ: MS + 0,3mg/l BAP + 1mg/l NAA + 1% than hoạt tính + 6,5g/l agar + 50g/l khoai tây + 10% Nước dừa+ 20g/l đường .
2.d. Đưa cây ra ngoài vườn ươm trồng
Trước khi ra cây, đưa các bình cây từ phòng nuôi ra ngoài môi trường tự nhiên khoảng 2 tuần để luyện cây.
Các cây sau khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn chiều cao khoảng 4 – 5 cm, có 3 – 4 lá tiến hành ra cây.
Dùng kẹp có móc cẩn thận lấy cây ra khỏi bình, nên kéo phần gốc ra trước, dùng nước rửa sạch các môi trường bám xung quanh, tránh không làm đứt rễ. Xử lý ngâm vào trong dung dịch khử trùng hoặc dung dịch thuốc tím loãng 0,05% trong 5 phút tăng tỷ lệ sống, đồng thời có tác dụng hiệu quả đối với một số cây bị nhiễm khuẩn.
Giá thể trồng: Đất guột nhiều mùn+ Sơ dừa.  Sơ dừa được xé nhỏ, mịn ngâm trong nước vôi loãng từ 5-7 ngày.
Đất guột nhiều mùn xử lý sạch nguồn bệnh bằng tritrodema (ủ 2 tuần).
Trồng cây có độ chặt, độ sâu vừa phải đảm bảo chắc gốc nhưng không nén chặt quá làm ảnh hưởng đến sự thông thoáng của rễ, trồng cây x cây = 5-10 cm. Buổi Sáng tưới cây từ 8-9h, chiều từ 16-17h, tười bằng bình phun sương.
Sau khi trồng được một tháng quan sát cây đã sinh trưởng bình thường thì tiến hành phun nhẹ phân bón qua lá ( 7 đến 10 ngày phun 1 lần).

Cây Lan Kim tuyến hay còn gọi là Lan gấm, cây Kim cương.Tên khoa học là: Anoectochilus setaseus. BlumeCao Bằng là tỉnh có nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú, đa dạng, có nhiều loài thực vật quý hiếm, trong đó cây Kim tuyến là cây rất quý nằm trong sách đỏ Việt nam.Để bảo tồn cây Lan Kim Tuyến, ngoài các giải pháp như bảo vệ cây mọc ở rừng tự nhiên, đem cây về trồng chăm sóc tại vườn thì giải pháp áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô là biện pháp tối ưu nhất với nhiều đặc điểm ưu việt như : Cho hệ số nhân cao, chủ động được thời gian ra cây giống, bảo vệ tốt nguồn Gen quý hiếm.Hóa chất sử dụng cho môi trường nuôi cấy cần được chuẩn bị trước ở dạng đậm đặc và bảo quản trong tủ lạnh, khi sử dụng pha loãng ra. Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy mô Lan Kim tuyến là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có các thành phần trong bảng sau:Chuẩn bị các chất điều hòa sinh trưởng: các chất điều hòa sinh trưởng cũng được pha đặc ở dạng dung dịch gốc gồm các chất trong bảng sau:Quy trình nuôi cấy mô cây lan Kim Tuyến invitro trong phòng thí nghiệm bao gồm 4 giai đoạn chính từ giai đoạn chọn vật liệu khởi đầu đến giai đoạn ra rễ tạo được cây hoàn chỉnh.Vật liệu được sử dụng để cấy mô in vitro cây Lan Kim tuyến trong phòng thí nghiệm là các lóng giữa và chồi đỉnh của cây Kim tuyến khỏe mạnh, có chiều cao khoảng 15 – 20 cm, được thu hái từ rừng tự nhiên.Cây Kim Tuyến là loài thực vật dạng thân bò, chia đốt. Trên mỗi đốt hình thành 1 rễ và 1 chồi đối xứng nhau. Chồi ngủ của cây trên mỗi đốt được bao bọc bởi các bẹ lá. Chính vì vậy, vật liệu khởi đầu để tiến hành vi nhân giống cây lan Kim Tuyến là phần thân chồi, đặc biệt là những chồi mập, khỏe và vươn cao khỏi mặt đất.Ở giai đoạn này mục đích là tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu vô trùng đưa vào nuôi cấy.Cây Lan Kim tuyến sau khi thu hái ở rừng được bảo quản cẩn thận cây còn nguyên, không được dập nát khô héo. Sau đó, chọn những cây mập có đường kính từ 3-5mm trở lên (cây mập sẽ cho chồi khỏe và có khả năng tái sinh cao); cắt bỏ phần rễ, phiến lá (giữ lại phần bẹ lá có tác dụng bảo vệ chồi ngủ). Rửa mẫu cấy bằng nước sạch sau đó đưa mẫu vào bình thủy tinh lắc đều với dung dịch xà phòng trong 10 phút. Tráng sạch xà phòng 7 lần bằng nước cất.Tiến hành trong box cấy vô trùng với 2 bước.- Bước 1: Khử trùng mẫu.Mẫu sau khi đưa vào box cấy vô trùng sẽ được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70, sau đó đưa mẫu vào bình thủy tinh vô trùng lắc đều với dung dịch HgCl0,1%. Với thời gian là 10 phút. Tráng lại mẫu nhiều lần bằng nước cất vô trùng 2 lần( khoảng 6 -7 lần sẽ rửa sạch được dung dịch HgClcòn dư trong mẫu) mẫu nuôi cấy sẽ có tỉ lệ vô trùng cao. Sau đó cắt thành từng đốt dài từ 2-3 cm rồi cắm mẫu cấy vào môi trường MS đã chuẩn bị trước 1 tuần ( môi trường chuẩn bị trước 1 tuần mục đích nhằm hạn chế phát hiện môi trường nhiễm khuẩn, nấm).Bước 2: Chuyển mẫu sang môi trường tái sinh.Sau khi mẫu được cấy khoảng 3 tuần từ lúc khử trùng, quan sát các mẫu, mẫu nào xanh, không bị chết và nhiễm khuẩn sẽ tiến hành tách bỏ những đoạn đã bị dập (chú ý không gây tổn thương các chồi ngủ). Sau đó dùng panh dài gắp và cắm mẫu nuôi cấy lên môi trường tái sinh vô trùng được chuẩn bị trước 1 tuần.Môi trường cấy tái sinh:½ MS + 1 mg/l KI + 1mg/l BAP + 10% Nước dừa+ 50g/l chuối+ 6,5g/l agar + 20g/l đườngĐược tiến hành trong box cấy vô trùng.Sau khi đưa mẫu, chồi được tái sinh, tiến hành nhân nhanh chồi. Đưa mẫu ra khỏi bình môi trường cũ, tiến hành tách chồi mới tái sinh khỏi phần thân cũ. Lưu ý không làm tổn thương chồi cây, không nên cắt quá sát phần gốc chồi. Sau đó tiến hành cấy chồi vào môi trường nhân nhanh đã được chuẩn bị trước 1 tuần.Môi trường nhân: MS + 3,0mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 6,5g/l agar + 50g/l khoai tây + 10% Nước dừa+ 20g/l đường + 50g/l chuối.Tiến hành trong box cấy vô trùng.Sau quá trình nhân nhanh chồi sẽ được nuôi lớn ( cây khỏe mạnh, nhanh thích nghi với môi trường bên ngoài. Sau đó tiến hành cấy chuyển sang môi trường tạo rễ đã được chuẩn bị trước 1 tuần. Ở giai đoạn này, chỉ tiến hành tách chồi chứ không chia nhỏ, cắt bỏ rễ như giai đoạn nhân nhanh.Môi trường ra rễ: MS + 0,3mg/l BAP + 1mg/l NAA + 1% than hoạt tính + 6,5g/l agar + 50g/l khoai tây + 10% Nước dừa+ 20g/l đường .Trước khi ra cây, đưa các bình cây từ phòng nuôi ra ngoài môi trường tự nhiên khoảng 2 tuần để luyện cây.Các cây sau khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn chiều cao khoảng 4 – 5 cm, có 3 – 4 lá tiến hành ra cây.Dùng kẹp có móc cẩn thận lấy cây ra khỏi bình, nên kéo phần gốc ra trước, dùng nước rửa sạch các môi trường bám xung quanh, tránh không làm đứt rễ. Xử lý ngâm vào trong dung dịch khử trùng hoặc dung dịch thuốc tím loãng 0,05% trong 5 phút tăng tỷ lệ sống, đồng thời có tác dụng hiệu quả đối với một số cây bị nhiễm khuẩn.Giá thể trồng: Đất guột nhiều mùn+ Sơ dừa. Sơ dừa được xé nhỏ, mịn ngâm trong nước vôi loãng từ 5-7 ngày.Đất guột nhiều mùn xử lý sạch nguồn bệnh bằng tritrodema (ủ 2 tuần).Trồng cây có độ chặt, độ sâu vừa phải đảm bảo chắc gốc nhưng không nén chặt quá làm ảnh hưởng đến sự thông thoáng của rễ, trồng cây x cây = 5-10 cm. Buổi Sáng tưới cây từ 8-9h, chiều từ 16-17h, tười bằng bình phun sương.Sau khi trồng được một tháng quan sát cây đã sinh trưởng bình thường thì tiến hành phun nhẹ phân bón qua lá ( 7 đến 10 ngày phun 1 lần).

ĐÁNH GIÁ post
Bài viết liên quan

Tư vấn miễn phí (24/7) 094 179 2255